Glossar
Biotin-Markierung
Biotinylierung verleiht einem Peptid einen femtomolaren Anker für die Streptavidin-Bindung. Spacerlänge, endogenes Biotin und Elutionsgrenzen erklärt.
Eine Biotin-Markierung ist ein Biotinmolekül (Vitamin B7), das an ein Peptid konjugiert ist, normalerweise am N-Terminus oder an einer Lysin-Seitenkette. Ihr Wert liegt in der Streptavidin-Wechselwirkung: eine Dissoziationskonstante im femtomolaren Bereich, eine der stärksten nicht-kovalenten Bindungen der Biologie, stabil gegenüber Detergenzien, hohen Salzkonzentrationen und moderaten Denaturierungsmitteln.
Wie sie eingesetzt wird und was sie einschränkt
Biotinylierte Peptide sind das Standardwerkzeug für Pull-downs und Zielidentifizierung mit Streptavidin-Magnetbeads, für die Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten ELISA-Platten und SPR-Chips sowie für die verstärkte Detektion, bei der ein Streptavidin-HRP-Konjugat einen markierten Sekundärantikörper ersetzt.
Drei praktische Einschränkungen treten immer wieder auf. Erstens die Spacerlänge: Der Valeriansäure-Schwanz des Biotins ist kurz und die Bindungstasche tief, daher wird normalerweise ein Aminohexansäure- oder PEG-Linker eingefügt, damit das Peptid zugänglich bleibt. Zweitens endogenes Biotin: Gewebe wie Leber, Niere und Gehirn enthalten genug freies Biotin, um zu konkurrieren, was einen Avidin/Biotin-Blockierungsschritt erfordert. Drittens die Elution: Die Wechselwirkung ist so stark, dass die Gewinnung intakter Komplexe in der Regel Kochen in SDS, einen Überschuss an freiem Biotin über lange Inkubation oder einen von Anfang an eingeplanten spaltbaren Linker erfordert.
Verwandte Begriffe und Materialien
FAM/FITC-Markierung · I-125-Radiomarkierung · Reinheit. Referenzmaterial: markierte Peptide, markierte Antikörper. Weiterführende Lektüre: Leitfaden zu markierten Peptiden.